利用微波快速高效水解寵物食品中的氨基酸

　更新時(shí)間：2022-11-10　點(diǎn)擊量：1082

介紹

蛋白質(zhì)在濕寵物食品和干寵物食品的生產(chǎn)過(guò)程中起著(zhù)重要作用。蛋白質(zhì)的質(zhì)量和數量不僅影響生產(chǎn)的總成本，還影響消費者對產(chǎn)品的興趣。評估膳食蛋白質(zhì)質(zhì)量的一種方法是通過(guò)氨基酸水解檢查樣品的總氨基酸含量。通常，蛋白質(zhì)在酸性或堿性條件下水解24小時(shí)以上。這種處理打破了蛋白質(zhì)中氨基酸殘基之間的肽鍵，終實(shí)現了每個(gè)氨基酸的鑒定和定量。由于常規加熱的特點(diǎn)是緩慢的體積加熱、不穩定的熱梯度和不一致的反應產(chǎn)率，因此需要較長(cháng)的反應時(shí)間。

微波輔助反應已被強調為一種顯著(zhù)縮短水解時(shí)間、提高反應產(chǎn)率和重現性的方法。1,2 CEM的Discover®2.0微波反應器為優(yōu)化蛋白質(zhì)水解反應提供了一條級好的途徑。在此，對濕和干寵物食品進(jìn)行傳統的酸水解以及優(yōu)化的微波輔助水解條件。使用Waters AccQ Tag™ 超衍生試劑盒，通過(guò)柱前衍生法測定每個(gè)樣品的氨基酸含量，然后在260nm下進(jìn)行LC-PDA分析?？偟膩?lái)說(shuō)，Discover 2.0的結果較優(yōu)于傳統水解，且具有關(guān)鍵的優(yōu)點(diǎn)，包括更短的反應時(shí)間、更清潔的水解產(chǎn)物和更快的分析時(shí)間。

材料和方法

試劑和樣品

化學(xué)品從商業(yè)供應商處購買(mǎi)，未經(jīng)進(jìn)一步純化即可使用。用于傳統和微波輔助氨基酸水解的溶液在使用前新鮮制備。所有玻璃器皿在110°C的空氣烘箱中干燥4小時(shí)。所有寵物食品樣品均化并儲存在陰涼干燥的地方（對于干樣品）或4ºC（對于濕樣品），直到分析。使用分析天平將每個(gè)樣品的40至50mg部分稱(chēng)重到其反應容器中。使用Waters AccQ Tag Ultra Derivation試劑盒分析所有樣品，用于260nm下的LC-PDA分析。

傳統酸水解法

將寵物食品樣品加入清潔干燥的10 mL玻璃瓶中，然后加入2mL 6 N HCl。然后用N2吹掃小瓶，快速密封，然后放入110°C 空氣烘箱中24小時(shí)。將樣品水解物冷卻至室溫，然后通過(guò)0.2 µm PTFE過(guò)濾器。然后用6M NaOH中和無(wú)顆粒樣品，以準備AccQ Tag衍生化。

Discover 2.0 水解方法

水解反應制備：將各樣品的50 mg部分添加到配備有微攪拌棒的35mL Pyrex容器中。用移液管將5mL體積的含1%苯酚（w/v）的6N HCl移到每個(gè)容器中。用N2流吹掃容器5分鐘，用Tefon內襯硅帽快速密封，并放置在自動(dòng)取樣器架中，以便自動(dòng)放置到Discover 2.0腔中。反應完成后，將冷卻的樣品中和并過(guò)濾，以準備AccQ Tag™ 衍生化。

方法編程：在Discover 2.0系統中編程一步動(dòng)態(tài)法，用于寵物食品樣品的氨基酸水解。

酸水解

容器類(lèi)型：Pyrex

控制類(lèi)型：動(dòng)態(tài)

溫度：160°C

時(shí)間：30分鐘

壓力：300 PSI

功率：300 W

攪拌：高

分析樣品制備

對于AccQ Tag衍生化，將來(lái)自Waters AccQ Tag-Ultra衍生化試劑盒的70µL硼酸鹽緩沖液添加到完整的回收小瓶中，然后添加10µL過(guò)濾和中和的樣品。將小瓶蓋上并使用旋渦混合器混合。此外，將20µL從Waters試劑盒制備的衍生化試劑添加到每個(gè)樣品反應中，移液管jian端直接置于反應溶液中。在分析之前，將總反應渦旋10秒，然后在55℃下加熱10分鐘。

分析

將4µL每種衍生反應注入ACQUITY™上變頻器™ 系統，連接到Waters PDA探測器。在Waters AccQ Tag Ultra C18柱（1.7µm，2.1 x 100 mm）上以0.4 mL/min的流速進(jìn)行分離。柱溫為55℃。洗脫梯度如表1所示。流動(dòng)相為A:Waters AccQ Tag洗脫液A，在MilliQ水中稀釋10倍，B:Waters-AccQ Tag-Eluent B。為了測定每種氨基酸的氨基酸濃度，將Waters氨基酸標準品（Waters Corporation，零件號WAT088122）衍生為以下濃度：1、5、10、25、50和100 pmol/µL，并且所得到的線(xiàn)性曲線(xiàn)被強制通過(guò)零。所有分析均使用Waters TargetLynx軟件™進(jìn)行。

表1. 用于衍生氨基酸分離的梯度

結果和討論

使用CEM的Discover 2.0微波反應系統對干狗（貓）糧和濕寵物食品樣品進(jìn)行微波輔助氨基酸水解。每種水解產(chǎn)物的氨基酸含量通過(guò)柱前衍生化測定，隨后通過(guò)配備PDA檢測器的LC分析測定，PDA檢測器設置為在260nm下監測。將結果與從相同樣品的傳統烘箱水解反應獲得的結果進(jìn)行比較。傳統的結果被認為是*的回收率。表2描述了每個(gè)氨基酸殘基與其傳統水解對應物的回收率。對于干和濕寵物食品樣品，所有回收率均在可接受的回收率范圍內，即60至130%。此外，與傳統水解反應相比，微波輔助反應的標準偏差更高（如圖1所示）。

與傳統水解反應相比，微波輔助反應在標準偏差方面表現出更高的精度（如圖1所示）。

Discover 2.0與傳統氨基酸水解協(xié)議相比具有多種優(yōu)勢。添加磁攪拌有助于樣品的均勻性，而壓縮空氣冷卻使反應容器在幾分鐘內達到安全的處理溫度。Discover 2.0的微波加熱機制提供了與傳統加熱相當的結果，在30分鐘內提高了精度，從而縮短了分析時(shí)間，并為反應優(yōu)化提供了更大的機會(huì )。該方法還代表了用于酸和堿氨基酸水解反應的安全和自動(dòng)化平臺。

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表2. 干濕寵物食品中氨基酸的回收率——微波輔助與傳統氨基酸水解

寵物食品圖1.png

圖1. 濕寵物食品的氨基酸水解結果

結論

這項研究強調了CEM的Discover 2.0是一種有效的方法，可用于濕寵物食品和干寵物食品的氨基酸水解?？偟膩?lái)說(shuō)，Discover 2.0的結果在準確性和精密度方面較優(yōu)于傳統的烘箱水解結果，主要優(yōu)點(diǎn)是反應時(shí)間更短、水解產(chǎn)物更清潔、分析時(shí)間更快。

參考文獻

1 Chen, S. T.; Chiou, S. H.; Chu, Y. H.; Wang, K. T. Int. J. Pept. Protein Res. 1987, 30, 572-576.

2 Margolis, S. A.; Jassie, L.; Kingston, H. M. J. Automat. Chem. 1991, 13, 93-95.

AccQ-Tag™, ACQUITY™ UPLC™ , and TargetLynx™ are trademarks of Waters Corporation.

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