【CEM】Fmoc-His(Boc)-OH在基于Fmoc的固相肽合成中的應用

一、組氨酸的差向異構化

對映體純度極大地影響肽的生物活性；因此，避免D-異構體含量的增加至關(guān)重要。¹在固相肽合成（SPPS）的偶聯(lián)過(guò)程激活階段，組氨酸特別容易發(fā)生差向異構化。組氨酸傾向于差向異構化（圖1）是一種分子內的副反應，這是由于咪唑N^π上的孤對電子與酸性α碳氫的接近性所導致。當氨基酸被激活時(shí)，1號位的孤對電子具有足夠的堿性以進(jìn)行去質(zhì)子化，從而形成一個(gè)無(wú)立體選擇性的酯烯醇鹽2²。

此時(shí)，轉化為L-或D-異構體3并沒(méi)有熱力學(xué)上的優(yōu)先途徑。當反應位點(diǎn)聚集，且組氨酸在激活狀態(tài)保持較長(cháng)時(shí)間的期間，差向異構化的可能性增加。

二、組氨酸側鏈保護

對咪唑環(huán)的保護（圖2）通常采用在N^τ位置使用三苯甲基（Trt）基團的方式實(shí)現⁴。Trt基團因其體積大和具有吸電子性，能夠有效抑制諸如環(huán)上N-?；雀狈磻?，然而在控制差向異構化方面效果有限。其他側鏈保護基團，尤其是那些提供N^π保護的，例如Fmoc-His(π-Mbom)-OH（5），通過(guò)阻斷α-氫的接觸途徑來(lái)減少差向異構化。但這些衍生物的缺點(diǎn)在于它們本身的高成本和因多步驟合成策略導致的低批量供應，這種策略需要在連接Mbom基團時(shí)對N^α位置進(jìn)行互斥保護。^3,4,5,6此外，在肽切割過(guò)程中還需添加額外的清除劑，以防止新暴露的氨基功能團上發(fā)生羥甲基化。

本文中，Fmoc-His(Boc)-OH（6）被證實(shí)是Fmoc SPPS中組氨酸并入的寶貴替代物，因為它在高溫下對差向異構化具有較高的穩定性，成本低，且比其他任何市場(chǎng)上可購買(mǎi)的衍生物具有更好的批量供應能力。

三、Fmoc-His(Boc)-OH的優(yōu)勢

Fmoc-His(Boc)-OH 能夠以游離酸和環(huán)己胺（CHA）鹽的形式大量購買(mǎi)。對于鹽形式，需要通過(guò)提取過(guò)程來(lái)移除CHA基團。鑒于這一過(guò)程相對繁瑣，我們的研究便專(zhuān)注于游離酸的應用。根據先前的報告，與His(Trt) 相比，His(Boc)在差向異構化方面的傾向性更低。⁷這一現象可以歸因于氨基甲酸酯基團較強的吸電子效應，它有效地從π子中抽取電子云密度，從而降低了其堿性。

四、討論

一項采用利拉魯肽和^1-42Beta淀粉樣蛋白的可行性研究評估了-Boc基團在微波（MW）輔助固相肽合成（SPPS）過(guò)程中對差向異構化的抑制效果及側鏈的穩定性。肽段是在HE-SPPS條件下制備的，具體操作包括1分鐘90°C的去保護和2分鐘90°C使用DIC和Oxyma Pure進(jìn)行的偶聯(lián)。⁸與基于尿嘧啶的激活策略相比，DIC/Oxyma Pure激活在偶聯(lián)效率和抑制差向異構化方面提供了更優(yōu)的結果。后者的表現歸因于碳二亞胺活化所固有的酸性環(huán)境。^9,10在室溫或稍高的條件（例如50°C）下并入組氨酸能進(jìn)一步降低D-異構體的形成，但這樣的條件對于His(Trt)仍然不夠理想。我們比較了His(Trt)和His(Boc)在使用兩種常見(jiàn)協(xié)議時(shí)的偶聯(lián)條件：（1）10分鐘50°C和（2）2分鐘90°C。最后，我們研究了溶液中的穩定性，以確定其在Liberty Blue^TM HT12上的高通量自動(dòng)化應用的可行性。

利拉魯肽的合成

利拉魯肽具有一個(gè)N端的組氨酸，這在與肽鏈的偶聯(lián)中存在一定難度，因此，通過(guò)微波加熱來(lái)增強?；饔檬怯幸娴?。使用三苯甲基保護在50°C下偶聯(lián)組氨酸10分鐘，結果顯示D-異構體的形成增加到了6.8%（如表1所示）。在相同條件下，Fmoc-His(Boc)-OH顯著(zhù)減少了差向異構化，僅為0.18%。

Fmoc-His(Boc)-OH在90°C時(shí)的表現也相當出色，觀(guān)察到的差向異構化水平為0.81%，相比之下His(Trt)則大于16%。Fmoc-His(Trt)-OH和Fmoc-His(Boc)-OH都以相當的粗純度獲得了目標肽（圖3）。Fmoc-His(π-Mbom)-OH在純度和D-His方面提供了與Fmoc-His(Boc)-OH相似的結果。

表1：利拉魯肽中組氨酸在不同偶聯(lián)條件下的D-異構體形成情況

1-42Beta淀粉樣的合成

之前的研究表明，在長(cháng)時(shí)間的哌啶處理過(guò)程中，N^τ-Boc側鏈基團顯示出不穩定性。¹¹為了測試高溫去保護過(guò)程中–Boc的穩定性，我們合成了包含三個(gè)組氨酸殘基的^1-42Beta淀粉樣蛋白。^1-42Beta淀粉樣蛋白的合成序列是出了名的困難，需要使用特殊的偶聯(lián)試劑，即使在嚴苛條件下，產(chǎn)物純度通常也過(guò)低，無(wú)法進(jìn)行分析和純化。¹²與常規合成方法不同，HE-SPPS即便在未優(yōu)化的條件下也能獲得木及高的粗純度。我們比較了His(Trt)和His(Boc)在50°C下偶聯(lián)10分鐘以及90°C下偶聯(lián)2分鐘的情況。His(Boc)將總合成時(shí)間從4小時(shí)24分鐘縮短到3小時(shí)58分鐘，并且將差向異構化的比例從2.88%降低至1.29% D-異構體（表2）。UPLC分析表明，這兩種合成方法得到的目標產(chǎn)物在粗純度上具有可比性（圖4）。

表2：BA中His(Trt)和His(Boc)的差向異構化情況

圖4：使用(a) His(Trt)和(b) His(Boc)的1-42 Beta淀粉樣蛋白的UPLC色譜圖

溶液中的穩定性

在自動(dòng)化高通量SPPS應用中，要求底物能在溶液中保持溶解狀態(tài)長(cháng)達10天。通常，像組氨酸這樣的反應物由于保護基團的降解/丟失而導致變色和沉淀，其溶液壽命僅限于5天。在這項研究中，我們測試了組氨酸溶液（DMF，0.2 M）在大氣條件下存放10天的穩定性（圖5）。所有樣品都迅速溶解，得到無(wú)色溶液。Fmoc-His(Trt)-OH的變色在短短24小時(shí)內就開(kāi)始出現，并在10天的時(shí)間里加劇。10天后，Fmoc-His(π-Mbom)-OH溶液略呈黃色，而Fmoc-His(Boc)-OH溶液在研究期間保持無(wú)色。UPLC分析表明，Fmoc-His(Boc)-OH和Fmoc-His(π-Mbom)-OH保持了>99%的純度?；趶娏业淖兩?，預計在10天的研究期間Fmoc-His(Trt)-OH樣品中形成了幾種雜質(zhì)（圖6）。然而，使用質(zhì)譜對這些雜質(zhì)進(jìn)行定性未能成功。

圖6. 10天后DMF中組氨酸衍生物(0.2 M)的UPLC分析；(a) = Fmoc-His(Trt)-OH (b) = Fmoc-His(π-Mbom)-OH (c) = Fmoc-His(Boc)-OH

五、結論

上述數據表明，His(Boc)是一種強大的組氨酸衍生物，可以在90°C下高效偶聯(lián)，提供優(yōu)良的粗純度，同時(shí)縮短偶聯(lián)時(shí)間并顯著(zhù)降低差向異構化。與其他抑制差向異構化的N保護衍生物相比，Fmoc-His(Boc)-OH更易獲得，同時(shí)保持相當的合成性能。總之，Fmoc-His(Boc)-OH的核心優(yōu)勢包括：

• 商業(yè)批量可用性強，價(jià)格相對于Fmoc-His(Trt)-OH更具競爭力

• 在高溫下具有低水平的差向異構化；50°C及以下的偶聯(lián)溫度使得Fmoc-His(Boc)-OH適用于活性藥物成分的合成，無(wú)需復雜的偶聯(lián)試劑和條件¹³

• 優(yōu)異的溶液穩定性；與Fmoc-His(π-Mbom)-OH相當，且優(yōu)于Fmoc-His(Trt)-OH

六、材料與方法

試劑

以下Fmoc氨基酸和樹(shù)脂購自位于Matthews，NC的CEM公司，包含所示的側鏈保護基團：Ala, Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OMpe), Gln(Trt), Gly, His(Boc), His(Trt), Ile, Leu, Lys(Boc), Lys(palmitoyl-Glu-OtBu), Phe, Pro, Ser(tBu), Tyr(tBu), Val。Rink Amide ProTideTM LL, Cl-MPA ProTideTM LL, 以及Fmoc-Gly Wang PS LL樹(shù)脂也購自CEM公司。二異丙基碳二亞胺（DIC），哌啶，三氟乙酉夋（TFA），3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇（DODT）和三異丙基硅烷（TIS）購自Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）。二氯甲烷（DCM），N,N-二甲基甲酰胺（DMF），無(wú)水二乙酉迷（Et₂O），乙酸，高效液相色譜級水，以及乙腈購自VWR（West Chester, PA）。液相色譜-質(zhì)譜級水（H₂O）和液相色譜-質(zhì)譜級乙腈（MeCN）購自Fisher Scientific（Waltham, MA）。D-異構體通過(guò)手性GC-MS（C.A.T. GmbH）進(jìn)行測定。

肽合成：利拉魯肽

在CEM Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成器上，以0.10 mmol的規模合成了該肽。使用了0.313克Fmoc Gly Wang PS LL樹(shù)脂（0.32 meq/g置換）。去保護作用采用20%哌啶和0.1 M Oxyma Pure在DMF中執行。偶聯(lián)反應使用5倍過(guò)量的0.2 M Fmoc-AA、1.0 M DIC和1.0 M Oxyma Pure在DMF（CarboMAX）中進(jìn)行。切割則應用CEM Razor™高通量肽切割系統，配比為92.5:2.5:2.5 TFA/H₂O/TIS/DODT。切割后，肽通過(guò)Et₂O沉淀并過(guò)夜凍干。

肽合成：1-42Beta淀粉樣蛋白

采用CEM Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成器，以0.10 mmol的規模在0.512g Cl-MPA ProTide樹(shù)脂（0.19 meq/g置換）上合成了該肽。去保護作用使用20%哌啶和0.1 M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。偶聯(lián)反應用5倍過(guò)量的0.2 M Fmoc-AA、1.0 M DIC和1.0 M Oxyma Pure在DMF（CarboMAX）中進(jìn)行。切割采用CEM Razor™高通量肽切割系統，配比為92.5:2.5:2.5 TFA/H₂O/TIS/DODT。切割后，肽通過(guò)Et₂O沉淀并過(guò)夜凍干。

穩定性研究

在50毫升離心管中，制備了0.2摩爾濃度的組氨酸溶液（總共5毫升DMF），并對管進(jìn)行了密封。這些溶液在實(shí)驗室環(huán)境下保持在室溫，持續10天。為了準備用于超高效液相色譜-質(zhì)譜分析的樣品，將10微升的組氨酸溶液稀釋到5毫升的50/50（體積比）乙腈和水的混合溶劑中。調整進(jìn)樣量，直至吸光度達到35 – 55單位。

七、參考文獻

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